研究背景
目前的研究表明多种病因学通路与自闭症患病风险增加是相关的。例如，很多单基因综合征和其他罕见新生突变已经被证实在自闭症儿童中有很高的外显性，当然现在还有很多未发现的遗传因素。一些罕见的高置信度的基因突变显著发生在参与突触功能、转录调控和染色质重塑功能的基因中。
早前的双胞胎研究表明，尽管遗传因素在孤独症的病因学中起着重要的作用，但是环境因素也不容忽视。最近的证据也表明遗传、环境因素及其相互作用可能在胎儿大脑发育的早期起作用，通过影响一些重要通路蛋白质或基因的表达，使自闭症儿童表现出差异性。因此，研究者认为可以通过构建环境因素影响模型来研究环境因素在胎儿大脑发育早期阶段的影响。
早前临床研究已经证实母亲孕期病毒或细菌感染会使胎儿大脑早期发育发生变化，并增加后代患自闭症的风险。欲研究母亲孕期感染对胎儿大脑发育的影响，可以构建母体免疫激活模型。目前常用的方法有在大鼠或小鼠孕期注射poly(I:C)和脂多糖来诱导母体免疫激活状态。研究已表明poly(I:C)和脂多糖会影响母体通过胎盘的细胞因子信号，进而影响胎儿大脑的发育，也会阻断一些对神经元有保护作用的关键通路，从而诱导出存在自闭症样行为的动物模型。
尽管目前已经知道母体免疫激活与自闭症病理学间存在关联，但母体免疫激活如何在基因组和表观遗传学水平上对发育中的胎儿大脑产生影响还不明确。因此研究者开展了此研究，欲探寻母体免疫激活对自闭症相关遗传风险机制的影响。
研究结果
1.早前的研究对SD大鼠在孕期第15天经腹腔注射脂多糖以诱导母体免疫激活状态，之后分别在4小时和24小时后采集胎鼠的大脑组织开展转录组测序。本研究的研究者下载了这部分数据进行分析，发现在母体免疫激活4小时后，胎鼠的转录组失调，与对照组胎鼠相比，母体免疫激活的胎鼠中有4959个基因显著下调，有4033个基因显著上调（）。与母体免疫激活4小时影响不同的是，在母体免疫激活24小时后，胎鼠大脑的差异表达基因减少，只有一个基因（MAIN）显著下调，有两个基因（LCP2,RPL39）显著上调。因此后续的分析均基于母体免疫激活4小时的数据。
2.为了研究母体免疫激活下调基因在自闭症风险基因中的富集程度，研究者对这部分下调的基因开展了通路分析，发现母体免疫激活下调基因大多与早期皮层发育、神经发生和晚期皮层发育功能相关。之后研究者从当前一项全外显子测序研究中提取了35个与自闭症相关的基因紊乱变体，发现这35基因紊乱变体中的20个存在于母体免疫激活下调的基因中。此外，与自闭症相关的错义突变和SFARI数据库中与自闭症相关的基因均显著富集于母体免疫激活下调的基因中。这些结果表明，在大脑发育的早期阶段，母体免疫激活可能通过下调与自闭症相关基因的表达来增加子代患自闭症的风险，如下图所示。
3.为了研究母体免疫激活上调基因在自闭症风险基因中的富集程度，研究者对这部分上调的基因开展了通路分析，发现母体免疫激活上调的基因在神经发生和早期大脑发育过程中起到了重要作用。早前有证据表明母体免疫激活下调的基因与自闭症高度相关，说明母体免疫激活对这些基因及其调控的下游分子有重要的影响。因此研究者靶向验证了两个基因，一个是与神经发育进程相关的FMR1基因，一个是涉及转录、DNA完整性和信号转导的CHD8基因，结果表明母体免疫激活没有对FMR1基因和CHD8基因产生影响。但母体免疫激活是否会对这两个基因的下游基因产生影响呢？因此研究者提取了两个FMRP基因的靶基因集，发现母体免疫激活下调的基因显著富集于FMRP基因的两个靶基因集，而母体免疫激活上调的基因只富集于两个FMRP基因靶基因集的一个。此外，研究者也从人胎脑组织、神经干细胞（第一个）和神经祖细胞中（第二个）提取了两个CHD8基因的靶基因集，发现只有母体免疫激活下调的基因显著富集于第一个CHD8靶基因集，而母体免疫激活上调和下调的基因均显著富集于第二个CHD8靶基因集，说明虽然母体免疫激活不直接对FMR1基因和CHD8基因产生影响，但是它可能通过扰乱这两个基因下游的靶基因，对神经发育进程产生影响，如下图所示。
4.为了验证母体免疫激活扰乱的胎鼠基因在自闭症儿童和成年人皮质转录本中也存在失调，研究者对两套早前发表的自闭症患者尸检的大脑转录本进行分析，发现在这两套数据集中上调和下调的基因也分别显著富集于大鼠母体免疫激活上调和下调的基因集中。共同下调的这部分基因显著富集于运输_突触小泡胞吐、神经发生_突触形成和细胞粘附_突触接触等生物学过程，共同上调的这部分基因显著富集于翻译起始进程。但是仍有94-97%母体免疫激活下调的基因和96-97%母体免疫激活上调基因为大鼠特有的差异表达基因。
5.为了验证母体免疫激活导致大鼠系统水平转录组的紊乱与人体大脑皮质是否存在相似性，研究者对母体免疫激活转录组数据集和人大脑转录组的数据集开展了加权基因共表达网络分析，发现在两套人大脑转录组数据集中共表达的模块有4个，即M25、M3、M9和M13，这4个模块在母体免疫激活数据集中也有一定保守性。其中富集于M25模块中的基因在孤独症逝者皮质组织中上调，它们参与了翻译起始和翻译延长-终止生物进程。富集于M3、M9和M13模块中的基因在孤独症逝者皮质组织中下调，它们参与了突触功能的行使。之后研究者利用两种保守统计方法对孤独者逝者皮质基因模块和免疫母体激活基因模块间的保守性进行分析，发现M25模块是最保守的。
6.PI3K–TSC1/2–mTOR信号通路在早前已经被发现与孤独症密切相关，为了探索基于网络分析发现的在动物和人体中保守的M25模块基因功能是否会对该通路产生影响，研究者构建了M25模块的靶基因集，功能分析发现这些靶基因显著富集于细胞周期相变调节进程、包含关键调控基因（PI3K,、STATs、CDK和mTOR）的发育进程和帽依赖的翻译调控基因（EIF4E），说明M25模块富集的基因可能会影响PI3K–TSC1/2–mTOR信号通路和EIF4E基因的表达和活性。
7.为了直接量化母体免疫激活和M25模块失调对PI3K–TSC1/2–mTOR信号通路的影响，研究者利用数据库生成了包含该通路的最短路径网络，该网络包含84个基因。在该网络中发现显著富集有母体免疫激活的差异表达基因和M25模块的靶基因。值得注意的是，母体免疫激活中所有PI3K–TSC1/2–mTOR信号通路中的关键基因均表达失调，说明母体免疫激活和孤独症患者皮质转录组的失调可能涉及PI3K–TSC1/2–mTOR信号通路，该通路能调控EIF4E介导的翻译，如下图所示。
8.为了验证提出的假说，研究者构建了母体免疫激活的小鼠模型，去验证了Tsc1/2、mTor、EIF4EBP1/2和Eif4e基因mRNA表达水平的变化，发现母体免疫激活使小鼠胎脑Tsc1/2、mTor、EIF4EBP1/2基因表达下调，而Eif4e基因表达上调，说明母体免疫激活诱导的转录本失调涉及Tsc1/2–mTor–Eif4ebp1/2轴参与的翻译进程，如下图所示。
