我们真掌握了上帝之手吗？3D打印人体器官技术的前世今生（下）

在上篇中，我们回顾了组织器官工程技术的缘起。那究竟SEEDAWARD2019大奖得主以色列Matricelf团队，是如何在前沿技术的基础上，攻破了3D打印器官的一系列难题的呢？

Matricelf团队的研究背后，涉及细胞和非细胞物质分离、细胞重编程、细胞诱导分化为心脏细胞和内皮细胞、细胞外基质（ECM）水凝胶环境搭建等多种技术，是一整套前沿技术的系统工程，除了本身极高的技术壁垒之外，还涉及跨学科应用、工艺流程和系统化等问题。为了便于理解，我们可以其类比为传统的打印技术，分为“墨水”、“载体环境”和“打印机”三类。

2006年，日本京都大学的山中伸弥教授团队发现，只需将Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4四种与干细胞特性相关的转录因子（也被称为“山中因子”）通过反转录病毒的方式导入小鼠皮肤纤维母细胞，就可以促使纤维母细胞重编程，形成具有多能性干细胞的分化能力。这样的细胞被称为诱导式多能干细胞（iPScell）。2012年，因对“体细胞重编程技术”的研究，时任京都大学教授的山中伸弥获得当年的诺贝尔生理或医学奖。

图：诱导式多能干细胞(iPS)可以将体细胞再分化成其他组织细胞

诱导式多能干细胞与胚胎干细胞（ES）形态相似、核型、端粒酶活性、体外分化潜能均相同，同时也能够表达相同的表面标志分子。简单理解，即通过诱导式多能干细胞技术重编程得来的iPS细胞具备和胚胎干细胞一样的多种分化能力，使得在体外诱导分化出心脏细胞、神经细胞、上皮细胞等器官组成细胞成为可能，为器官3D打印提供了“细胞墨水”支持。

Matricelf团队采用从人体胃部大网膜提取出来的基质细胞，使用诱导式多能干细胞技术将其“重编程”为iPS细胞，并且再诱导分化出3D打印心脏所需要的心脏细胞和上皮细胞，作为3D打印的材料。

ECM，即细胞外基质，是由细胞分泌到细胞外间质中的大分子物质，其能构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。之所以称其为“载体环境”，是因为可以类比传统的金属粉末3D打印——为了使打印中的粉末材料和整个打印环境受保护，金属粉末3D打印机会将整个打印环境充满氩气等惰性气体，氩气就是金属粉末3D打印中的“载体环境”。在器官3D打印中，细胞和胶原蛋白是打印的“墨水”，为了使打印出来的细胞不受物理破坏，也需要有“载体环境”进行保护，这时候就需要含有ECM的水凝胶来做支撑。

图：ECM水凝胶支撑细胞结构不受物理破坏

需要说明的是，ECM水凝胶除了保护的作用外，在临床前研究中已经被证明其对某些疾病有潜在的疗效，比如由于外周动脉疾病引起的血液循环不良。心脏病发作后，疤痕组织的形成会削弱心肌功能，导致心力衰竭。而此时一旦注射ECM水凝胶到受损的心肌中，ECM水凝胶就会形成一个健康细胞迁移的修复环境，导致心肌增加，疤痕组织减少，心脏功能改善。因此，ECM水凝胶环境对细胞打印的自修复自愈合有促进作用。

器官3D打印的重头戏自然是被归为“打印机”的两种技术——FRESH技术（悬浮水凝胶自由形式可逆嵌入技术）和SWIFT技术（牺牲写入功能组织技术）。

图：FRESH技术图解

FRESH技术是由卡耐基梅隆大学的AdamFeinberg教授团队研发的创新3D生物打印技术，以胶原蛋白（即ECM的主要组成成分）和细胞为目标打印材料，制造出具有更高分辨率、图案可以更复杂的人体器官组织支架。但胶原蛋白和细胞都是液态的，为了让让胶原蛋白保持完整的组织形状，同时保持高分辨率和高保真度，团队开发了FRESH技术——该技术以明胶作为支撑床，特定浓度的胶原蛋白从灵活的打印喷嘴中挤出后，可以在支撑胶中逐层沉积和凝固。等到打印完成，研究人员把温度从室温调整到体温（37度），就可以让支撑用的明胶融化，同时让打印出来的胶原蛋白结构、嵌入胶原蛋白中的细胞保持完好。

利用FRESH技术，科学家用细胞和胶原蛋白成功打印出不同尺寸的心脏零件：小到毛细血管，大到与新生儿心脏相当的人类心脏模型，包括血管系统、腔室之间的瓣膜等结构。而且，分辨率最高达到20微米，大大超过原有技术100~500微米的分辨率。

图：利用FRESH技术打印的心脏零件模型

SWIFT技术则是由哈佛大学Wyss生物启发工程研究所研发的3D打印血管通道技术。相比FRESH技术，据媒体报道“SWIFT专注于打印支持含有大量器官构建块（OBB）的活体组织构建所必需的血管，而不是试图3D打印整个器官的细胞，而最终可用于治疗以修复和替换人体器官。SWIFT技术首先将数十万个多能干细胞聚集体混合ECM水凝胶形成一个密集的活体OBB基质，每毫升含有约2亿个细胞；第二步，通过写入和去除牺牲油墨建立血管网络，氧气和其他营养物质通过血管网络可以被输送到嵌入基质内的细胞”。

在0到4度的低温下，混合ECM水凝胶和多能干细胞的致密基质具有足够的稠度和柔软度，使其可以在不损坏细胞的情况下进行3D打印的喷涂操作；而当基质被加热到37度时，基质会变硬，基质中的明胶部分会融化并可被简单清除，留下3D打印的血管通道。

器官打印目前还面临打印速度慢、细胞存活率不高的瓶颈。而SEEDAWARD2019北美赛区十强项目中，RS3Dprint团队带来了创新的解决方案。传统组织3D打印中，无论是细胞还是其他材料，都是逐层打印，不断堆叠，即“分层物体制造”（LOM)。这种方法不仅会造成细胞层之间互相挤压导致细胞死亡，过长的打印时间也很难使得大部分细胞保持活性。加州大学伯克利分校机械工程学院著名教授BorisRubinsky就提出，可以像工业流水线一样进行打印流程拆解：多台打印机并行工作，每台打印机打印单层细胞结构，打印完之后马上对单层细胞进行精确冷冻保证存活率。在“中央组装厂”（类似汽车生产流水线的总装车间），再把不同层组织进行连接，最终“总装”成为3D结构。这种方法被团队称为“Cryoprinting”（冷冻3D打印）及“Parallellithography”（并行印刷），通过实验和计算表明，该技术可使每立方米产品的大规模生产时间缩短数千小时,同时大大提高组织打印的细胞存活率。

图：BorisRubinsky教授提出的并行印刷流程图

目前，Boris教授正将这种生物3D打印技术应用于食品工业。2019年大火的人造肉公司BeyondMeat和ImpossibleFood的产品，都是模拟碎肉饼，尚无完整的肉质结构出现。通过逐层打印和统一总装，可以大大缩短人造肉打印的时间成本，同时还能精确控制肉质口感，打印出真正具有肉质纤维纹理和口感的产品。

图：通过逐层冷冻打印、统一总装的打印流程可以精确控制肉质结构和纹理，批量打印出更具真实质感的人造肉

图：BorisRubinsky教授带队参加SEEDAWARD北美复选

值得一提的是，BorisRubinsky教授是一位跨学科、高产的真正创想者。其研究领域包括医疗影像、生物医药、低温医疗、微纳米仿生技术等。早在1982年，他便与GaryOnik教授一起，首次利用超声波为肿瘤冷冻治疗进行定位和监测，开创了影像引导的冷冻治疗学，大大提高了冷冻治疗的准确性和可靠性。该技术逐渐成熟演变成为今天的氩氦刀技术（氩氦冷冻消融技术），目前已经广泛应用于肺癌、肝癌等多种癌症治疗手术。

经过数代创想者不懈努力，伴随人体器官移植、动物器官移植、人造器官、诱导式多能干细胞技术、ECM细胞外基质水凝胶开发、FRESH悬浮水凝胶自由形式可逆嵌入技术/SWIFT牺牲写入功能组织技术、冷冻3D打印-并行印刷技术等多个子领域的发展，组织器官工程技术已经走进现实。

图：Matricelf正在进行心脏打印

2019年4月，特拉维夫大学分子细胞生物学与生物科技学院的TalDvir教授团队成功利用患者自身的脂肪细胞和生物材料“打印”出了世界上第一个拥有血管、完整心室和心房的3D工程化心脏。经过特拉维夫大学技术转化组织（TTO机制）的孵化，2019年下半年Matricelf正式成立，团队开始承担3D心脏打印项目的商业化运营。

Matricelf团队研发并工程化的3D心脏打印技术，其生物材料源自全部患者本身身体内的细胞，在世界范围内首次突破了传统器官移植采用的异体移植带来的长期持续且剧烈的排异反应问题，有望彻底免除患者长期服用免疫抑制剂的痛苦。这一重大医学突破为人体器官移植和组织器官工程的发展开辟了新的道路。

Matricelf团队在SEEDAWARD全球总决选现场带来的打印心脏样品长度只有2.5厘米，和兔子的心脏大小相仿，并且心脏上的细胞还不具备泵血功能，仅能收缩，但它拥有与人类心脏相同的腔室和血管，后续可以利用相同的工业化技术制作真正的人类心脏。虽然目前研究的前沿方向还面临扩展多种生物材料“墨水”、亿级大批量细胞打印等工程化难题，但距离打印一个真正可以运作的人体心脏可能仅需要不到十年时间。

作为一个商业化项目，Matricelf制定了不同阶段的目标。目前其核心应用场景为脊髓损伤修复。脊髓损伤修复和心肌梗塞修复都是三大核心技术之一——“载体环境”ECM水凝胶的工程化应用。要最终实现临床的心脏打印，必须先将三大核心技术成熟落地，而脊髓损伤修复是将ECM水凝胶技术成熟落地的方向之一，目前学术界对这个方向有较多研究。

图：ECM凝胶修复心肌

当然，Matricelf团队还需解决一系列更加复杂、实际的问题：

横向拓展更多种类细胞、纤维蛋白、透明质酸、藻酸盐等各种软性生物材料等多种“墨水”材料，完善打印能力；

（要打印完整的心脏，至少需要打印四种心脏组成细胞，因此必须完善打印能力）

未来要打印相同尺寸的人体器官需要上亿级别细胞的打印技术，对器官3D打印技术的批量工作能力、打印精度、连续生产能力等都有更高要求；

“打印机”、“墨水”和“载体环境”三大核心技术的工程化落地和商业化探索。

在接下来的十年长征里，追求精益创业的Matricelf团队已经有了明确的分步商业化策略，而基于ECM水凝胶技术的脊髓损伤修复解决方案和急性心肌梗塞修复解决方案是接下来团队商业化进程的重要发力方向。不管是“墨水”iPScell、“载体环境”ECM水凝胶或者“打印机”FRESH/SWIFT技术，其每一项在各自领域都是非常前沿的技术，基于以上核心技术，逐一拓展工程化和商业化能力，分化出大量“微创新”解决方案，是Matricelf团队商业化策略的重中之重。最终，在3D心脏打印技术的这颗超级大树下面，将会包括脊髓损伤修复、心肌梗塞修复等众多疑难杂症的解决方案。

组织器官工程前景广阔，需求非常强烈：虽然每年有超过3万例器官移植手术，但是还有超过11.3万名患者在等候器官移植。我们推测未来的主要研发方向包括：

FRESH/SWIFT技术是平台性技术，未来需要横向拓展纤维蛋白、透明质酸、藻酸盐等各种软性生物材料等多种“墨水”材料，完善打印能力；

当前的3D打印技术还只能打印等比例缩小的器官，未来要打印相同尺寸的人体器官需要上亿级别细胞的打印技术，对器官3D打印技术的批量工作能力、打印精度、连续生产能力等都有更高要求；

除了3D打印技术外，并行的几种技术路线：比如微模具成型技术、微流体纺丝技术等在近几年都有长足的发展，未来会综合运用在组织器官工程的不同领域。